为什么在微孔板阅读器中使用单色仪?

微孔板读者用于许多科学领域的广泛方法。一些方法,如发光,不需要任何波长选择的手段,因为所有的光子被捆绑在一起来计算样品的发光。然而,大多数方法需要将测量波长限制在窄带宽范围内的能力:例如,测量感兴趣物质的最大吸收附近的吸收,仅激活单个荧光团或分离不同报告蛋白的发射。

传统上,滤光片是用来选择所需波长的:由于其高透过率和阻隔性,滤光片价格低廉,使用方便,灵敏度高。然而,它们缺乏灵活性,因为使用不同的波长需要使用不同的过滤装置,它们不适合测量一种物质的光谱。了解更多关于单色仪的原理和类型

单色仪主要用于测定吸光度和荧光强度。

Microplate Reader最相关的单色器规格

光谱范围(波长范围)

市场上的许多微孔板读者覆盖了230nm至1000nm的吸收范围。使用我们的系统,您可以使用高达200nm的单色器。当测量荧光时,许多微孔板阅读器只能测量700或740 nm。我们的仪器可以覆盖范围高达850 nm

频谱带宽

光谱带宽(也称为光谱带通量)被定义为光线的宽度,其中光已达到最大值的一半(半最大,缩写为FWHM的全宽。狭缝宽度决定了光谱带宽:狭缝宽度较宽,较窄的光谱带宽。市场上的许多酶标器具有固定的光谱带宽。然而,我们的微孔板阅读器配有单色仪,都有可变带宽:从4 nm(或6,取决于设备)到22 nm。当激发和发射峰非常靠近时,较窄的带宽提高了分辨率,建议用于荧光。更广泛的带宽将信号提高到噪声比。具有可变光谱带宽的单色器对于优化棘手的测定非常有用。

阻止效率

阻塞效率是波长选择系统阻断不需要的波长的能力(除了在单色仪中选择的范围),并且对于实现良好的信噪比至关重要。它表示为退出单色仪的不需要光的级分:10个阻塞效率为10-3意味着没有阻挡1/1000的不需要的波长光并退出单色镜。大多数酶标读者使用双重单色器配置实现10的阻塞效率-6,这是大多数荧光强度测定所必需的。

杂散光

杂散光是测量的光量,其在与所选波长不同的波长下离开单色仪。它是分散元件或其他光学表面,衍射效果,其他光学像差或损坏和磨损部件的缺陷的辐射。

在吸收测量中,散射光会导致偏离朗伯-比尔定律。在高吸收值时,散射光对吸收与浓度的线性关系有很大的影响。随着浓度的增加,它会产生系统的偏倚,使吸收降低。杂散光也是影响分析线性动态范围上限的主要参数,在荧光测量中也会引起问题。

杂散光表示为出单色仪的光的分数:指数为10-4意味着离开单色仪的光的1/10000是杂散光。

而市场上大多数微孔板读卡器的杂散光指数在3 x 10之间-45 x 10-4,由Berthold Technologies公司生产的仪器具有优异的10指数-6,也就是说,至少有20倍,在所有单色测量中提供最高的可靠性。

光谱分辨率

分辨率是在单色仪中可以设置的最小带通;一旦单色元件及其位置被固定,分辨率就由最小狭缝宽度决定。分辨率对于准确测定样品的光谱至关重要。原来锐利的光谱峰在低分辨率测量时扩大,甚至可能消失使用宽缝宽度;窄缝可以使光谱形状更接近原始光谱。在图1中,你可以看到光谱扫描中分辨率影响的一个例子:当分辨率为4 nm时,500 nm左右的3个峰看起来比1 nm时要平坦,但它们仍然很容易区分;然而,当分辨率为15纳米时,它们似乎融合成一个单峰,导致信息丢失。

我们微孔板读者中使用的单色器具有4或6 nm的光谱分辨率(取决于设备),虽然许多竞争者仅具有9,15甚至20nm的荧光分辨率。

图1:光谱分辨率对光谱扫描的影响

什么时候用滤镜测量,什么时候用单色仪测量?

这取决于特定的分析方法。对于某些测量,例如。荧光偏振,必须使用过滤器,因为不能轻易调整单色器中的偏振。在其他情况下,例如BRET,用单色器难以实现所需的敏感性。

通常,利用滤光器制造的测量值提供比在可比较仪器中用单色器制成的相同测量的敏感性。然而,在许多情况下,单色仪提供的敏感性足够好,灵活性和便利性是一个受欢迎的Plus。

来自Berthold Technologies的基于单色仪的微孔板阅读器提供了两种最好的选择:您可以自由选择过滤器和单色仪,为您的分析提供最佳性能的选择。

我们的单色微孔板阅读器

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