BRET原则

BRET是基于这样一个事实,即如果荧光素酶反应的能量可以用来激发荧光蛋白,如果后者靠近荧光素酶。这项技术涉及到将供体(荧光素酶)和受体(荧光)分子融合到感兴趣的蛋白质上。融合构造在活细胞中的共表达使它们的相互作用能够以定量的方式实时研究。能量通过非辐射偶极-偶极耦合从供体转移到受体,当接近时(通常在10纳米内),导致荧光发射在一个特征波长。受体发出的能量相对于供体发出的能量被称为BRET信号,或BRET比率。它取决于给体和受体分子的光谱性质、比例、距离和相对取向,以及感兴趣的蛋白质之间相互作用的强度和稳定性。

BRET很像烦恼但在焦躁中,供体也是一种荧光蛋白,必须被激发。由于BRET不需要外部光源来激发供体,它的背景很低,也不存在经常与FRET相关的问题,如自发荧光、光散射或光漂白。BRET的其他优点是,它是一种非放射性的均匀技术,比率信号最小化了来自测定条件的干扰。

BRET方法

在过去的几年里,不同的BRET方法被开发出来。所有这些都有其局限性和好处。各种供体和受体对及其对应波长见下表:

方法 捐赠 底物 供体发射(nm) 受体 受体发射(nm)
BRET 1 RLuc Coelenterazine 480 eYFP 530
BRET 2 RLuc 深蓝C™ 395 绿色荧光蛋白 510
eBRET 2 RLuc8 深蓝C™ 395 绿色荧光蛋白 510
BRET 3 萤火虫 荧光素 565 安全域 583
QD-BRET RLuc / RLuc8 Coelenterazine 480 QDot 605
NanoBRET NanoLuc® Furimazine 460 HaloTag®配体 618

BRET 1

最初的BRET方法以腔肠嘧啶为底物,现在称为BRET 1。其特点是信号强,使用寿命长。

BRET 2

与BRET 1相比,它有更好的施主和受体分离发射峰。这使得BRET 2成为需要高信噪比的检测筛选的更好选择。BRET 2的一个明显的局限性是低光发射和短寿命。

增强型BRET 2 (eBRET)

eBRET产生的信号大约是原来BRET 2版本的5倍。eBRET使用了一种新的肾荧光素酶突变体Rluc8。

BRET 3

bret3中的萤火虫荧光素酶在发射波长(565 nm)处表现出较低的细胞自发荧光,但缺点是信号微弱,供体和受体发射峰之间存在重叠。

QD-BRET

一个全新的BRET版本是量子点BRET (QD-BRET)。发射峰明显分离,使QD-BRET成为理想的筛选应用。缺点是QD分子的大小(1.5 - 6 nm)和QD蛋白的遗传编码是不可能的。QD蛋白不能在活细胞中表达,但必须添加。

NanoBRET™

NanoBRET™使用荧光素酶比传统的荧光素酶,NanoLuc®,并有非常好的分离施主发射(460 nm)和受主发射(618 nm)。

BRET应用程序

BRET可以用酶标仪测量来研究蛋白质相互作用特别是g蛋白偶联受体的研究。研究活的哺乳动物细胞相互作用的能力,避免了许多与免疫共沉淀和酵母双杂交筛选技术相关的问题。此外,BRET的高灵敏度使研究生理浓度下的蛋白质成为可能,这比需要高水平蛋白表达的技术具有显著优势。

特别是在g蛋白耦合受体研究领域,建立齐次BRET技术提供了机会,环球和功能测定,利用这一事实ß-arrestin(这是自然发挥作用的受体的脱敏)结合到细胞内激活受体的一部分。g蛋白偶联受体,也被称为7-跨膜(7TM)受体,包括已知的最大和最多样的蛋白质超家族。只有一小部分是已知的配体。

为了了解GPCRs在药物发现中的重要性:

  • 目前~ 30%的药物是针对GPCRs的
  • 只有5%的已知受体被药物靶向
  • 已知的配体只占其余的20%

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一个标仪光度计能够使用滤光片测量高灵敏度的发光是BRET的最佳组合;读者与单色仪也可以使用,但灵敏度降低。需要在不同波长进行2次测量,因此需要一个至少有2个发射滤光片的阅读器(这是不可能的,例如,阅读器使用一个带有1个激励滤光片+ 1个发射滤光片的单个滤光片)。以下所有microplate阅读器都推荐给BRET。