基因由两个主要功能元素组成:首先由所谓的编码DNA序列组成,该编码DNA序列提供有关所产生的蛋白质的信息。其次,与调节基因转录的编码区连接的特定启动子序列。该启动子用于根据需要激活或抑制基因的表达。

报告基因测定的主要目的是研究利益基因的启动子,即其表达的调节。这可以通过将感兴趣的启动子与易于检测的基因联系起来,例如萤火虫荧光素酶的基因,其催化产生光的反应。

通常,然后将细胞暴露于不同的因素或条件,或者可以通过记者的顺序进行改变,通过测量发光的变化,可以容易地跟踪其效果。

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三星3是一款用户友好,价格实惠的基于滤光片的多模平板阅读器,提供了高效的吸光度,发光和荧光测量分析

报告基因的例子

常见的报告基因有β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和荧光素酶。多种检测方法(见下文)用于检测表达的报告基因蛋白。这包括发光、吸光度和荧光。

基于发光的测定是由于几个原因非常流行:

  • 它们有很高的灵敏度(根据特定的检测方法和使用的报告剂,比基于吸收或荧光的方法高10到10000倍)
  • 大多数细胞类型没有内源性荧光素酶活性
  • 发光分析具有较大的动态范围
  • 他们行动迅速
  • 它们的成本相对较低

使用a测量发光报告器测定发光计

通过检测方法报告基因

记者 发光 荧光 吸光度
荧光素酶
β-半乳糖苷酶(β-加仑)
β葡萄糖醛酸酶(β格斯)
分泌型碱性磷酸酶
绿色荧光蛋白(GFP)

萤火虫荧光素酶

最通用和共同的报告基因是北美萤火虫的荧光素酶Photinus Pyralis.。该蛋白不需要翻译后修饰的酶活性。它甚至没有毒性体内高浓度,可以在原核和真核细胞中使用。萤火虫荧光素酶在ATP,镁和氧存在下催化荧光素的生物发光氧化。

双荧光素酶®报告基因检测

双荧光素酶报告酶(DLR)检测系统包含两种不同的荧光素酶报告酶,在每个细胞中同时表达。萤火虫荧光素酶和海三色堇荧光素酶可以区分它们各自的生物发光底物,而不会交叉激活。萤火虫荧光素酶由兴趣启动子控制,肾荧光素酶由稳定表达的启动子控制;通过这种方式,肾细胞荧光素酶的表达可以用作内部控制,以补偿任何细胞数量的变化、转染效率和其他错误。虽然这很方便,但必须谨慎,以确保所有试验条件都不会改变肾荧光素酶的表达,因为这可能导致错误的结论。

新颖的荧光素酶

近年来,其他荧光素酶已被用于报告基因分析,如Gaussia,塞浦路纳或NanoLuc®荧光素酶。这些所谓的“新型”荧光酶比萤火虫或肾细胞荧光酶亮1000倍,通常还有其他优点,如稳定性更好,体积更小,细胞外分泌等。

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